最初に
ここでは接着細胞の細胞ストック作製法を記載していきます。
必要な試薬
- 培地(DMEM + 10%FBS + 1%P/S, 「培地の調製」で調製したもの)
- D-PBS(-)(細胞培養グレードの市販品を推奨)
- トリプシン-EDTA
- 細胞凍結保存液
- 70%エタノール
- トリパンブルー溶液
必要な機器
- ウォーターバス
- クリーンベンチ
- ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
- チップ(1 mL、200 µL)
- 遠沈管(15 mL)
- 培地吸引機
- 遠心分離機
- 1.5 mLチューブ
- 血球計算盤またはセルカウンター
- ピペッター(電動を推奨)
- ピペット(10 mL用)
- クライオチューブ
- 油性ペン
- 倒立顕微鏡
- -80℃ディープフリーザー
- 液体窒素タンク
プロトコル
- インキュベータからdishを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。
- ウォーターバスを37℃に設定し、培地及びD-PBS(-)を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
- dishを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
- 培養してきた培地をdishから全量、吸引除去後、1.で温めたD-PBS(-)を10 mLとり、dishに添加する。
- 添加後、D-PBS(-)をdishから全量、吸引除去する。
- 1 mLトリプシン-EDTAをdishに加えて、dishを揺らして、均一に液を行き渡らせる。
- インキュベータに入れて3分間インキュベートする。
注意ポイント
3分以上インキュベートしないで下さい。 - インキュベート後、dishを揺らして細胞が剥がれている事を確認する。
ポイント
あまり剥がれていない場合、dishを強く左右に揺すって下さい。もしくはピペットマンでdish中のトリプシン-EDTAを吸い、剥がれていない所にかけて下さい。 - 確認後、すぐに10 mLの培地をdishに添加する。
- 添加後、全量を15 mLの遠沈管に移す。
- 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
- 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
- 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
- 10 µLの13.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
- 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
- クライオチューブに油性ペンで「日付、継代数、細胞名」を記載する
- 生細胞数1 x 106 cellsに対して、凍結保存液を1 mL加え、ピペッティングで混和する。
- クライオチューブに1 mLずつ分注する。
- -80℃ディープフリーザーで凍結保存する。
- (オプション)必要に応じて液体窒素タンクで保存する。