浮遊細胞ストックの融解

最初に

ここでは浮遊細胞ストックの融解方法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/Sもしくは、RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/S + G-CSF, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 遠心分離機
• 培地吸引機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• T75フラスコ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

プロトコル

1. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を温めて、クリーンベンチ内にいれておく。
2. 液体窒素、-80℃冷凍庫から細胞ストックを持ってくる。
3. ストック容器を持ちながらすぐに1.で37℃に設定したウォーターバスで1分間温める。

   ポイント

   少し氷が解け残っている状態で取り出す。

4. 70%エタノールでストック容器を拭き、クリーンベンチ内に入れる。

5. ストック容器を開け、1.で温めておいた1 mLの培地を上からかけて混和する。

   ポイント

   1 mL入らない場合は、できる限り加える。

6. 15 mLの遠沈管に全量移す。
7. 培地を1 mL取り、細胞が入っていたストック容器に添加し、壁に残った液を回収し、6.の遠沈管に上から添加する。
8. もう一度、培地を1 mL取り、細胞が入っていたストック容器に添加し、壁に残った液を回収し、6.の遠沈管に上から添加する。
9. 細胞を回収した7.の遠沈管に培地を更に加え、5 mLにメスアップする。
10. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
11. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
12. 1 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
13. 10 µLの10.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
14. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
15. 10.で作成した細胞懸濁液をT75 フラスコに入れ、10 mLの培地を上から加える。
16. フラスコの上面に油性ペンで「日付、継代数(ここではP=1)、名前、細胞名」を記載する。
17. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
18. インキュベータにフラスコを移して培養する。
19. 翌日、細胞を確認する。