浮遊細胞の継代

最初に

ここでは浮遊細胞の継代方法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/Sもしくは、RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/S + G-CSF, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 培地吸引機
• 遠心分離機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• T75フラスコ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

 プロトコル

1. インキュベータからフラスコを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。80%コンフルエントに達していない場合は培地交換を行う。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. フラスコを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. T75フラスコから培地を全量、15 mL遠沈管に移す。
5. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
6. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
7. 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
8. 10 µLの13.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
9. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
10. T75フラスコへ継代する場合、生細胞数が1 x 10⁶ cellsになるように13.の細胞懸濁液をフラスコに添加し、培地を全容量が10 mLになるように添加する。
11. フラスコの上面に油性ペンで「日付、継代数(ここではP=1)、名前、細胞名」を記載する。
12. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
13. インキュベータにフラスコを移して培養する。
14. 翌日、細胞を確認する。